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Ao cursar microbiologia em nível superior, seu professor pode requerer que você complete um projeto em que deve identificar uma bactéria desconhecida através de uma série de testes. Para identificar corretamente essa bactéria, é necessário ter todo um equipamento adequado de laboratório e conhecer vários procedimentos laboratoriais. É também vantajoso ter um fluxograma das bactérias e seus testes laboratoriais, para que possa identificar a sua bactéria.

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Placas de cultura permitem isolar as bactérias para identificar facilmente suas características (Hemera Technologies/Photos.com/Getty Images)

1. Prepare todos os teste antes de começar o experimento. Isso inclui preparar as placas de ágar e os tubos, bem como preparar os indicadores necessários, como o reagente de Kovac. Rotule todos os tubos e placas apropriadamente para que eles não se misturem, levando a resultados errôneos.

2. Faça uma semeadura das suas bactérias. Isso determinará a forma e a cor da sua bactéria, como as gram positivas (roxas), gram negativas (vermelhas ou rosas), cocos (circulares), espiroquetas (em forma de espiral) ou bastonetes. Para semear sua bactéria, precisará de uma lâmina limpa, água, violeta cristalizado, iodo, descorante, safranina, papel absorvente, um microscópio de luz composta e algumas toalhas de papel. Após flambar a alça calibrada (loop), use-a para colocar uma gota de água na lâmina. Flambe a alça novamente e, então, coloque uma pequena quantidade da sua bactéria desconhecida na gota de água. Passe a lâmina sobre a chama algumas vezes para secar e fixar completamente a bactéria à lâmina. Cubra-a com violeta cristalizado, deixe por um minuto e, então, lave-a suavemente. Depois, cubra a lâmina com iodo. Deixe por 30 segundos e, então, lave. Coloque um pedaço de papel absorvente por cima da lâmina para remover o excesso de água. A seguir, despeje o descorante na lâmina. Após cinco segundos, lave para retirar o descorante. Finalmente, cubra a lâmina com safranina. Após 40 segundos, lave a lâmina e seque-a suavemente com uma toalha de papel. Coloque uma gota de óleo no local das bactérias na lâmina e observe ao microscópio. Anote a forma e a coloração das bactérias visíveis.

   
   

3. Faça um teste da oxidase na sua bactéria. Para isso, precisará de um filtro de papel, um reagente oxidase, E. coli, Pseudomonas e a sua bactéria desconhecida. Nesse teste, a E. coli e a Pseudomonas são os controles. Sua bactéria deve ter menos de 24 horas de vida para esse teste. Flambe a alça e coloque uma pequena quantidade de cada bactéria em um pedaço de filtro de papel. Use um conta-gotas para colocar uma gota do reagente oxidase em cada bactéria. Após 10 segundos, anote a cor de cada bactéria. A E. coli dará um resultado positivo e a Pseudomonas dará um resultado negativo. As bactérias positivas para a enzima citocromo oxidase se tornarão roxas, e as negativas não mudarão de cor.

4. Faça uma prova do sulfeto de hidrogênio (SIM). Flambe a alça e use-a para pegar algumas bactérias da placa. Inocule o tubo SIM com a sua bactéria e cubra-o. Deixe esse tubo na estufa de 18 a 24 horas, a 37 ºC. Identifique se a sua bactéria é móvel (possui flagelo). Se existir crescimento e nebulosidade longe de onde você inoculou a bactéria, ela é móvel. A seguir, coloque duas gotas de reagente de Kovac no tubo. Se ele tiver qualquer mudança de cor para vermelho ou rosa, sua bactéria é positiva para esse teste e contém triptofano, sendo portanto, uma produtora de indol. Se o tubo se tornar preto, sua bactéria é produtora de sulfeto de hidrogênio.

   
   

5. Realize um teste de citrato de Simmon. Inocule a bactéria em dois tubos de teste com o ágar de Simmon. Deixe-os na estufa por 18 a 24 horas a 37 ºC. O ágar é inicialmente verde, mas se a sua bactéria usar o citrato como fonte de carbono, a cor mudará de verde para azul. O azul é o resultado positivo. Se os tubos permanecerem verde, sua bactéria é negativa para o uso de citrato como fonte única de carbono.

6. Realize uma prova de vermelho de metila (MRVP). Para esse teste, você precisa de dois tubos contendo uma solução de peptona, tampões e dextrose (ou glicose). Inocule cada tubo com a bactéria desconhecida e leve à estufa por 18 a 24 horas a 37 ºC. Quando prontos, adicione três gotas de vermelho de metila a um tubo. Esse será o seu tubo MR. Se o tubo mudar de amarelo para vermelho, sua bactéria é positiva e usa uma via ácida misturada durante a fermentação (são produzidos ácidos lático, acético e fórmico). No segundo tubo, adicione três gotas do reagente VP. Se o tubo se tornar vermelho, a bactéria é positiva para a formação de diacetil, um produto de fermentação. Se o tubo ficar marrom, a sua bactéria é negativa.

7. Encontre sua bactéria anotando os resultados positivos e negativos no fluxograma.